ncRNA研究利器：RNAscope原位雜交技術(shù)

導(dǎo)語(yǔ)

RNAscope是一種新型 RNA原位雜交技術(shù)，基于其獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)與背景抑制技術(shù)，并且融合傳統(tǒng)RNA原位雜交技術(shù)與FISH技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，使單個(gè)RNA的轉(zhuǎn)錄變得可視化，是目前最精準(zhǔn)的RNA檢測(cè)技術(shù)。

RNAscope?是一項(xiàng)用于檢測(cè)位于完整細(xì)胞中目標(biāo)RNA的定量原位雜交（in situ hybridization , ISH) 的新技術(shù)。該技術(shù)以其能放大特異性信號(hào)而非噪音信號(hào)的專利探針引物設(shè)計(jì)方法，代表了RNA原位雜交（ISH）領(lǐng)域一項(xiàng)重大進(jìn)步。

為了能夠顯著提高RNA原位雜交ISH的信號(hào)噪聲比，RNAscope?采用了一項(xiàng)原理已被證實(shí)的十分類似于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的設(shè)計(jì)原理。兩個(gè)獨(dú)立的引物探針 (Z形引物對(duì)) 需要隨機(jī)與目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。因?yàn)閮蓚€(gè)獨(dú)立引物相互緊挨同時(shí)相互互補(bǔ)結(jié)合到一個(gè)非目標(biāo)序列的可能性非常之小，這種設(shè)計(jì)原理保障了對(duì)目標(biāo)信號(hào)的特異性放大。

對(duì)于任意一個(gè)目標(biāo)RNA序列，都有一組獨(dú)特設(shè)計(jì)的20對(duì)Z形引物探針對(duì)只針對(duì)該目標(biāo)序列具有互補(bǔ)雜交特異性，而不會(huì)結(jié)合到非目標(biāo)片段上。

靈敏度：每三對(duì)Z形引物對(duì)足以實(shí)現(xiàn)對(duì)于單一RNA分子的檢測(cè)。在部分RNA段落不能被有效抵達(dá)或者RNA部分降解等情況下，20對(duì)Z形引物對(duì)的設(shè)計(jì)保障了足夠強(qiáng)勁的RNA檢測(cè)。

特異性：Z形引物對(duì)的設(shè)計(jì)屏蔽了背景噪音。單一的Z形引物探針對(duì)于非目標(biāo)序列的結(jié)合不能夠提供信號(hào)放大前體序列結(jié)合所需要的足夠長(zhǎng)度，以此防止了對(duì)于非特異信號(hào)的擴(kuò)增，保障了特異性。

單分子量級(jí)的可視性與定量分析： 此20x20x20x的引物設(shè)計(jì)與信號(hào)放大原理讓單一RNA分子能夠在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下以一個(gè)點(diǎn)狀信號(hào)的方式可視化呈現(xiàn)。

能夠檢測(cè)到降解了的RNA： 得益于其相對(duì)短小的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域(Z形引物對(duì)底端40到50個(gè)堿基的長(zhǎng)度)，此Z形引物對(duì)的設(shè)計(jì)為檢測(cè)到部分降解的RNA提供了保障。

實(shí)驗(yàn)方案可在6.5至8小時(shí)內(nèi)完成，時(shí)間長(zhǎng)短取決于不同的RNAscope?實(shí)驗(yàn)方法。手工染色步驟只需要2至2.5小時(shí)的操作時(shí)間，更快速的完成檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

每個(gè)點(diǎn)狀信號(hào)代表一個(gè)目的RNA分子，可在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察。通過(guò)RNAscope?SpotStudio?軟件進(jìn)行手工計(jì)算或自動(dòng)圖像分析，對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的信號(hào)進(jìn)行定量分析。

幾乎零本底，圖片相當(dāng)漂亮！